KIRJELDUS: RNaas R on E. coli eksoribonukleaas, mis näitab 3′-5 ‘eksonukleaasi harjutust, seedides tõhusalt praktiliselt kõiki lineaarseid RNA liike. See ensüüm ei seedi ümarat, lariat või kaheahelalist RNA -d lühikeste 3 ‘üleulatustega (madalam kui seitsme nukleotiidi). Sellisena sobib see ensüüm ideaalselt tavapärase splaissingu abil toodetud lariat RNA uurimiseks lisaks tsirkRNA-dele, mis tekivad tagasi splaissimise teel.
Mobiilsetest või RNA ekstraktidest lineaarsete RNA-de likvideerimisega hõlbustab RNaas R drastiliselt ümarate liikide tuvastamist RNA-järjestuse abil. See võimaldab teadlastel uurida sügavama splaissimise panoraami.

RAKENDUSED:

• CirRRNA -de rikastamine orgaanilistes proovides
• Introniliste lariat -järjestuste
tuvastamine
• Eksoonsete tsirkRNA -de tuvastamine • Erinevate splaissingute õppimine
• Sünteetiliste ümarate RNA -de tootmine

EZYME UNIT DEFINITION:

Üks ühik on kirjeldatud kui RNaas R kogus, mis muundab 1
µg polü (A) 10 minuti jooksul 37 ° C juures lahustuvaks nukleotiidiks. ENSÜÜMI HOIUSTAMISPUHVER: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT ja 50% (v/v) glütserool 10X RNaas R REAKTSIOONIPUHVRI KOMPONENDID: 200 mM Tris-HCl, 1 M KCl , 1 mM, MgCl2, pH 7,5.

HOIUSTUSTINGIMUSED: Jaemüüja temperatuuril -20 ° C.

Efektiivsuse säilitamiseks hoidke eemal kõikide osade korduvatest külmutamise-sulatamise tsüklitest. Kõik osad
on stabiilsed ühe 12 kuu jooksul alates transpordikuupäevast, kui need on õigesti salvestatud ja käsitletud.

NÄIDISTE TÖÖTLEMISE SUUNISED JA PROBLEEMIDE JÄRGIMINE:

• Täieliku RNA seedimiseks on mõnikord vaja pikemaid 2–3-tunnist inkubeerimist.
• Kui lagunemine on ebaefektiivne, kasutage vaevu kõrgendatud inkubatsioonitemperatuuri (40–45 ° C) ja täiendage täiendava ensüümi osaliselt (nt 0,5 μl 1 tunni pärast). Ülemine temperatuur on eriti kasulik äärmiselt struktureeritud lineaarsete RNA -de lagundamiseks, mis on samaväärsed rRNA -dega. Ärge ületage 45 ° C ega inkubeerige 3
tundi, kuna see põhjustab ensümaatilist RNA lagunemist.

• RNaas R näitab vähest koormust tRNA -le, rRNA -le ja erinevatele äärmiselt struktureeritud RNA -dele, mille puhul kolm ‘viimistlus on kaheahelaline ja lühikese 3’ üleulatusega. Need RNA liigid võivad ensüümi peatada ja lõppeda drastiliselt langetatud treeninguga. Kui täheldatakse ebaefektiivset lagunemist, kiidetakse see heaks nii seedimise parandamiseks, täiendava RNaas R kasutamiseks kui ka
rRNA eemaldamiseks täielikelt RNA ekstraktidelt enne seedimist.

• Pidage meeles, et ümmargused RNA-d sümboliseerivad väikest osa täielikust RNA-st (mõnikord 0,1%-0,01%), seetõttu lõpeb RNase R-i parandus kindlasti madala RNA-vahemikuga (pikogrammivahemik), mida enamus strateegiaid tõenäoliselt ei tuvasta. Sel põhjusel on algkogus vähemalt 10 µg täielikku RNA -d kasulik paljudele järgnevatele funktsioonidele.

• Kuigi ensüüm võib olla soojuse inaktiveeritud, ei tohiks see protsess olla kasulik, kuna liigne soojus võib põhjustada RNA kahjustusi. Asendajana võib kasutada fenool-kloroformi sadestamist. NGS -i puhul on kasulik tugeva osa pöörduva immobiliseerimise (SPRI) helmeste puhastamine.

• Optimaalse treeningu jaoks on vajalik magneesium kontsentratsioonis 0,1–1 null mM. Kui ETA on
praegune, kompenseerige, lisades MgCl2 kuni 1. Zero Mm lõplik fookus.

SEOTUD TOOTED:
• RNaas A (kataloogi nr M1227-25)
• RNaseOFF ribonukleaasi inhibiitor (kataloogi nr M1238-4000)
• DNaas, E.coli DNA ligaas (kataloogi nr M1217-100)
• Hüperlink-FAST 5-minutiline DNA sidumispakett (kass # Okei902-50)
• Uus T4 DNA ligaas (kass# M1247-200)
• T4 DNA ligaas (5 u/μl
) (kass# 9101-250)
• T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase) (kass# M1219-100)