Bioloogia olulised küsimused on see, kuidas genoomid rakkudes on organiseeritud ja kuidas genoomi 3D -struktuur mõjutab mobiilivõimeid. Bakteriaalne genoomne DNA asub rakkude sees äärmiselt kondenseerunud ja funktsionaalselt organiseeritud tüübis, mida nimetatakse nukleoidiks (tuumasarnane konstruktsioon ilma tuumamembraanita). Escherichia coli kromosoom või nukleoid koosneb genoomsest DNA -st, RNA -st ja proteiinist. Nukleoidid tekivad kondenseerumise ja ühe kromosomaalse DNA sihipärase seostamise abil, lisaks DNA ülekeerdumisele kromosomaalsete arhitektuursete valkude ja RNA molekulide abil. Kuigi bakteriaalse nukleoidi kõrge eraldusvõimega konstruktsioon on alles ees, tuleb viie aasta pikkuse analüüsi abil välja selgitada järgmised E. coli nukleoidi peamised võimalused:
1) kromosomaalne DNA on tavalisel negatiivselt ülekeerunud molekulil, mis on volditud plektoneemiliste aasadena ja mis on piiratud mähisevate topoloogiliste domeenidena ülemmähise difusiooni piirangute tõttu;
2) Silmused paigutatakse ruumiliselt megabaasi mõõtmetega piirkondadesse, mida nimetatakse makrodomeenideks ja mida iseloomustab DNA sagedaste füüsiliste interaktsioonide olemasolu DNA veebisaitide vahel kogu identse makrodomeeni vahel kui täiesti erinevate makrodomeenide vahel;
3) kondenseerunud ja ruumiliselt organiseeritud DNA on rakus radiaalselt piiratud spiraalse ellipsoidi tüüpi; ja
4) Kromosoomi DNA-l näib olevat haigusseisundist sõltuv 3-D konstruktsioon, mis on seotud geeniekspressiooniga, nii et nukleoidne struktuur ja geeni transkriptsioon on tihedalt üksteisest sõltuvad, mõjutades üksteist vastastikku. Eeldatakse, et osade kõrge eraldusvõimega mikroskoopia, ühe molekuli hindamise ja osade molekulaarse ülesehituse tahtejõud avaldavad bakteriaalse nukleoidi täieliku ehituse ja jõudluse.
Avage:
Sissejuhatus
Paljudes mikroorganismides on kromosoom üks kovalentselt suletud (ümmargune) kaheahelaline DNA molekul, mis kodeerib haploidset tüüpi geneetilist teavet. DNA skaala varieerub 500 000 miljonist aluspaarist (bp), mis kodeerivad 500 kuni tuhande organismi toetuva geeni arvu. Kromosomaalne DNA on rakkudes praegu väga kondenseerunud, organiseeritud tüübis, mida nimetatakse nukleoidiks (tuumasarnane) ja mis ei ole ümbritsetud tuumamembraaniga nagu eukarüootsetes rakkudes.
Kaugemal asuv nukleoid sisaldab 80% DNA -d, 10% valku ja 10% RNA -d [1, 2]. Sellel ekspositsioonil vaatame üle meie praegused andmed
i) kuidas kromosomaalne DNA muutub nukleoidiks,
ii) selles sisalduvad elemendid,
(iii) mida arvatakse selle ehitamisest ja
(iv) kuidas DNA struktuurilised tunnused mõjutavad geeniekspressiooni, kasutades mannekeenisüsteemina gramnegatiivset bakterit Escherichia coli. Lisaks juhime tähelepanu mõnele sellega seotud punktile, mis tuleb lahendada. See ekspositsioon on pikendus varasematele kriitikatele antud teemal [3, 4].
Nukleoidide moodustumisel on kaks olulist tunnust; suure DNA kondenseerumine väikesesse liikuvasse piirkonda ja sihipärane DNA rühm kolmemõõtmelises tüübis. E. coli haploidne ümmargune kromosoom koosneb ~ 4,6 x 106 bp. Kui DNA on B -tüüpi lõdvestunud, võib selle ümbermõõt olla ~ 1,5 millimeetrit (0,332 nm x 4,6 x 106) (joonis 1A). Sellegipoolest suur DNA molekul, kuna E. coli kromosomaalne DNA ei jää suspensioonis sirgeks paindumatuks molekuliks. Browni liikumine tekitab DNA kõverusi ja paindeid.
Kõige suurem suurus, milleni kahekordne spiraalne DNA jääb sirgeks, pidades vastu Browni liikumisega kaasnevale painutusele, on ~ 50 nm või 150 bp, mida nimetatakse püsivuse suuruseks. Seega puhas DNA muutub tunduvalt kondenseerunuks ilma lisaelementideta; termilises tasakaalus eeldab see juhusliku mähise tüüpi. E. coli kromosomaalse DNA juhuslik mähis (joonis 1B) hõivaks koguse (4/kolm π r3) ~ 523 μm3, arvutatuna giraadiumi raadiuse järgi (Rg = (√N a)/√6) koht a on Kuhni suurus (2 x püsivussuurus) ja N on Kuhni suuruse segmentide mitmekesisus DNA -s (DNA täissuurus jagatud a -ga). Kuigi DNA on juhusliku mähise tüübi sees juba kondenseerunud, ei saa ta siiski eeldada nukleoidi kogust, mis on väiksem kui mikron (joonis 1C). Seega pole DNA -le omane omadus piisav:
Escherichia-coli
Nukleoidide moodustumise teine oluline aspekt on DNA sihipärane seostamine. Kromosomaalset DNA -d ei kondenseerita, vaid täiendatakse funktsionaalselt lähenemisviisiga, mis sobib DNA transaktsiooniprotsessidega, mis on võrreldavad replikatsiooni, rekombinatsiooni, segregatsiooni ja transkriptsiooniga (joonis 1C). Praktiliselt viie aasta pikkune analüüs, mis algas 1971. aastal [1], on tõestanud, et nukleoidi lõplik tüüp tuleneb DNA hierarhilisest rühmast. Väikseimas skaalas (1 kb või palju vähem) nukleoididega seotud DNA arhitektuurvalgud kondenseeruvad ja korraldavad DNA, painutades, loopides, ühendades või pakkides DNA -d.
Suuremas mõõtkavas (10 kb või suurem) on DNA tüüpi plektoneemilised aasad, põimitud DNA tüüp, mis on indutseeritud superkeerutamisega. Megabaasi skaalal ühinevad plektoneemilised ahelad kuueks ruumiliselt organiseeritud domeeniks (makrodomeeniks), mida iseloomustab DNA -veebisaitide sagedane kehaline interaktsioon kogu identse makrodomeeni vahel kui täiesti erinevate makrodomeenide vahel [7]. Makrodomeenide sees ja vahel kujundatud pikad ja lühikesed DNA-DNA ühendused aitavad kaasa kondenseerumisele ja sihipärasele rühmale. Lõpuks on nukleoid spiraalne ellipsoid, mille pikiteljel on äärmiselt kondenseerunud DNA alad [8–10]. Me räägime nendest nukleoidi organisatsioonilistest võimalustest ja nende molekulaarsest alusest.
Põhiideed:
E. coli on geenide kloonimisel kõige populaarsem peremees, kuna DNA molekulid on rakkudesse sisse viidud liiga tõhusalt.
E. coli on kõige populaarsem peremeesorganism valkude tootmiseks, kuna selle kiire edenemine ja võimsus spetsiifilistele valkudele on väga suurtes vahemikes.
Bakterite konjugatsiooni saab kasutada massiivsete DNA fragmentide vahetamiseks ühelt bakterilt teisele.
E. coli on faagi bioloogia uurimisel kõige populaarsem peremees, kuna selle nukleiinhapete ja valkude biosünteesiradade kohta on üksikasjalikud andmed.
E. coli paindlikkus areneda keemiliselt piiritletud söötmel koos selle intensiivse geneetilise tööriistakastiga muudab selle võtmesüsteemiks bakteriaalsete ainevahetusradade uurimisel.
Escherichia-coli
DNA kloonimine Escherichia coli homoloogse rekombinatsiooni teel
Kokkuvõte
Ülemere DNA kloonimine Escherichia coli episoomides on molekulaarbioloogia nurgakivi. Pioneeritöö 1970ndate alguses, kasutades DNA ligaase DNA sidumiseks episomaalsetesse vektoritesse, on jätkuvalt sisuliselt kõige laialdasemalt kasutatav strateegia. Siin kirjeldame ainulaadset ettekirjutust, kasutades ET rekombinatsiooni 1 , 2 , suunatud kloonimiseks ja subkloonimiseks, mis annab üsna palju eeliseid. Kõige silmatorkavam on see, et valitud DNA piirkond kloonitakse peenest kombinatsioonist ilma eelneva eraldamiseta. Seetõttu sarnaneb kloonimine ET rekombinatsiooni abil PCR -iga, kuna igaüks neist sisaldab kahe valitud teguri vahelise DNA piirkonna amplifikatsiooni. Me rakendame seda meetodit valitud DNA -alade subkloonimiseks paljudest E. coli -s elavatest sihtmolekulidest peremeesorganisme ja kloonida valitud DNA piirkondi genoomsetest DNA preparaatidest. Siin analüüsime strateegia põhijooni ja esitame mitmeid näiteid, mis illustreerivad selle lihtsust, paindlikkust ja meeldejäävat tõhusust.
