Helmestel ja veergudel põhinevad eraldusstrateegiad sõltuvad tihedalt siduvusprogrammide kiirusest ja lihtsusest. Streptavidiini, antikehi ja lektiine meenutavaid ligande kasutatakse spetsiifiliselt märgistatud sihtmärkide hõivamiseks ning rakkude ja biomolekulide eraldamiseks, mis liigitavad ligandi siduva kaaslase loomulikult.
Taimsete lektiinide iseloomulikud sahhariide siduvad omadused, mis sarnanevad Concanavalin A-ga (Con A), on aidanud neid glükaani sisaldavate rakkude ja glükoproteiinide märgistamisel ja eraldamisel seerumis ja rakulüsaadis. Lektiini on lisaks kasutatud rakkude adhesiooni uurimisel, lümfotsüütide aktiveerimise mõjutamiseks ja süsivesikutel põhinevate ravimite avastamiseks.
Meie Con A-kattega BioMag Plus mikroosakesed on mugav vahend mannosüüli ja glükosüüli sisaldavate glükoproteiinide ja polüsahhariidide eraldamiseks seerumist või rakulüsaadist või erinevate lektiini / glükaani vahendatud protsesside uurimiseks. BioMag Concanavalin A -d on lisaks kasutatud CUT & RUN – kromatiini profileerimisprotokolli jaoks, millel on mitmeid olulisi eeliseid võrreldes ChIP -ga. (vt viiteid)
OMADUSED
Concanavalin A (Con A) on kovalentselt ühendatud funktsionaliseeritud BioMag Plus osakestega, mida kasutatakse glükoproteiinide eraldamiseks seerumist ja mobiilsetest ekstraktidest. Con A on 104 000 Da valk, mis koosneb Four sarnasest alaühikust ja eksisteerib energeetilise dimeeri või tetrameerina, mis sõltub pH -st. Selle süsivesikuid siduvad kaaslased on α-D-glükoos ja α-D-mannoos koos modifitseerimata OH-meeskondadega C-3, C-Four ja C-6 ning valkude ja peptiidide terminaalsed glükoosijäägid.
Con A aglutineerib roosasid vererakke (RBC), interakteerub immunoglobuliini glükopeptiididega ja on lümfotsüütide mitogeen. See seob mõnda mikroorganismi. Con A sidumist vahendavad metallioonid, mis stabiliseerivad konformatsiooni. Iga
siduv veebisait nõuab kaltsiumi ja mangaani ioone ning puhvrite kasutamine koos EDTA või erinevate metalliliste kelaatoritega toob kaasa süsivesikute sidumisoskuse puudumise.
concanavalin a
konkanavaliin a
Oletatav läbimõõt: ~ 1,Zero µm
Fookus: 5 mg/ml
Con Kindel: Otsustatud A280 MATERJALI
Materjalid Varustatud
Three ml või 10 ml Con A -ga kaetud osakesi 10 mM PBS -is koos 0,1% naatriumasiidiga
Vajalikud materjalid
1,5 ml või 2 ml mikrotsentrifuugitorud
Imetajate seerum: 0,Four ml 1:20 lahjendust PBS -is / vaadake
sidumispuhvrit: 1x PBS + 0,1% NaN3
+ 1 mM MgCl2
+ 1 mM MnCl2
+ 1 mM CaCl2
(pH 7,4)
pesupuhvrit: 1x PBS + 0,1% NaN3
+ 1 mM MgCl2
+ 1 mM MnCl2
+ 1 mM CaCl2
(pH 7,4) + 0,1% Tween® 20
Con A osakeste elueerimispuhver: 5 mM Tris (pH 8,0) + 0,15 M NaCl + 0,05% SDS + 1 M glükoos
Täpsed pipetid ühekordselt kasutatavate nippidega 20-200 µL, 200-1000 µL mikrotsentrifuugitoru
eraldaja: 1,5 ml magnetiline eraldaja (kataloogikood LS001) BioMag Multi-6 mikrotsentrifuugi torude eraldaja (kataloogikood MS002)
Vortex-mikser ja toru pöörleja.
concanavalin a cona
PROTSEDUUR
Teadlastel soovitatakse optimeerida osakeste kasutamist mis tahes utiliidis.
1. Pange kokku 0,Four ml seerumimustrit, lahjendades 1:20 10 mM PBS -iga.
2. Lülitage 1 ml BioMag®Plus Con A osakesi läbipaistvale mikrotsentrifuugi torule. Asetage toru magnetile, et eraldada osakesed eraldusvõimest.
Võtke vastus rangelt ära ja visake see ära.
3. Peske osakesi, lisades 1 ml sidumispuhvrit. Kombineeri korralikult.
4. Korrake osakeste pesemist 1 kord. Pärast viimast pesemist eemaldage supernatant.
5. Lisage seerumimustrile etapist 1 0,1 ml seondumispuhvrit. Lisage muster osakestele ja segage korralikult ümberpööramise või keerise abil, et osakesed uuesti suspendeerida.
6. Asetage muster toru pöörlejale ja segage 10-30 minutit toatemperatuuril.
7. Võtke muster rotatorilt ära ja asetage magnetseparaatorisse. Eemaldage puhastatud supernatant rangelt.
8. Peske osakesi, lisades 0,5 ml pesupuhvrit. Kombineerige korralikult ümberpööramise või keerise segamise teel.
9. Korrake samme 7-8. Suspendeerige osakesed uuesti 0,5 ml pesupuhvriga ja asetage toru pöörlejale viieks minutiks.
10. Korrake samme 7-9.
11. Asendage osakeste toru magnetseparaatoril ja eemaldage / eemaldage supernatant.
12. Lisage osakestele 250 µL elueerimispuhvrit. Osakeste resuspendeerimiseks ühendage katseklaas ja asetage toru 10–30 minutiks toatemperatuuril pöörlejale.
13. Asendage osakeste toru magnetseparaatoril ja eemaldage eluaat punktiivselt ning lülitage see läbipaistvale mikrotsentrifuugi torule hilisemaks kasutamiseks või säilitamiseks.
14. Korrake samme 12-13. Samuti võib eluaate ühendada ja sadestada. Jaemüüja elueerib jääl kiireks kasutamiseks või külmutab pikaajaliseks säilitamiseks. MÄRKUSED
• Hoidke eemal EDTA või erinevate metalliliste kelaatoritega reagentide kasutamisest, kuna see võib sidumispuhvri tõhusust vähendada.
• Proteaasi inhibiitoreid võib kasutada ka siis, kui õrnad glükoproteiinid on eemal.
• Madala glükoproteiini taastamise võib ühendada nii elueerimise inkubeerimisaja
pikendamisega üle 10 minuti ja / või osakeste keetmisega 200 µL SDS-PAGE puhvris viis minutit, seejärel eraldades osakesed magnetiliselt eluaadist. (Pange tähele: keetmine võib eraldada mõningaid lektiine ja
käivitada lisaks mittespetsiifiliselt kindlaid valke.)
• Käivitage eluaadiproovid SDS-PAGE 4-20% Tris-glütsiini elektroforeesigeelil ja määrige glükoproteiiniribad, kasutades GlycoGel Stain Tools
( polüteaduste kataloogi) Kood 24693) visualiseerimiseks.
• Pärast GlycoGel värvimist määrige geel, kasutades Coomassie G250 (1 ml või 2 ml 0,5% Coomassie G250 50% metanoolis ja 10% äädikhappes), et visualiseerida
erinevaid valguribasid.
• Albumiini ja IgG eemaldamine seerumiproovidest võib tõhustada madala fookusega glükoproteiinide eraldamist. Soovi korral kasutage BioMag® ProMax
albumiini eemaldamise seadmeid (kataloogikood BP658) ja / või BioMag® ProMax seerumi IgG eemaldusseadmeid (kataloogikood BP659).
